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R&D Systems 免疫组化产品常见问题

【 日期:2010-11-26 12:48:20  |  浏览次数:5035 】

R&D Systems位于细胞生物学行业领先地位,2009NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅只是低背景高信号的染色结果,而是可以反映组织生理学的真实结果。R&D Systems抗体低交叉反应,高特异性,保证了真实可靠的信号结果。中国区技术支持热线800-988-1270提供完善的技术咨询服务。

 

1. R&D Systems一抗的质量如何?

为可以保障实验结果的可靠性使用低交叉反应的高品质抗体。RD抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原,而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试,避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费,保证了真实可靠的信号结果。

 

2. R&D Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗?区分IHCICC吗?

R&D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选,能特异性识别石蜡和冰冻切片中的抗原,IHCICC相互通用。

 

3. IHC/ICC, 选择单抗还是多抗?

单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗,由单个B细胞克隆产生的,具有高亲和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族,单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变,如由于蛋白相互作用,翻译后修饰,温度,pH,固定,盐浓度等,单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。

 

由于多抗可以识别多个表位,不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说,在一定的pH值和盐浓度范围内,多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因,多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同,R& D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗(货号以AF开头),该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性,更加适合IHC/ICC实验。

 

 

4. 一抗试剂的孵育条件?一抗浓度,温度,时间?

一抗抗体浓度,稀释,孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化,以达到高特异性,低背景的信号。一般的优化过程是,保持固定的孵育时间和温度,同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如,使用一只高亲特异性抗体,可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间;或者,相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。为促进特异性染色,常选用较长的孵育时间及较低温度下进行(如室温和4˚C)。

 

R& D Systems的染色优化方案: 对于组织切片,一般起点是一抗4˚C孵育过夜; 对于染色细胞,一般起点是一抗室温孵育1小时温度。经抗原亲和纯化的多抗(货号以AF开头)(1.7-15 mg/mL) 较单抗的工作液浓度低(5-25 mg/mL)。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果,孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用一个新抗体时,建议进行初步实验以测试一个广范围抗体浓度。

5. 做石蜡切片IHC,推荐什么抗原修复技术?

(背景知识:日常工作中所使用的10%福尔马林固定的石蜡包埋组织,经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原,阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联,使被封闭的抗原充分暴露,抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节,不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。)

 

R&D Systems建议客户采用热修复的方法,并提供了高度优化的抗原修复试剂,有效修复抗原并提高免疫反应的效果:碱性抗原修复液(Catalog # CTS013), 酸性抗原修复液 (Catalog # CTS014) ,中性pH 7.0抗原修复液(Catalog # CTS015) ,含有前3种修复液的综合修复液 (Catalog # CTS016)。在R&D Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复 (Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。(具体见R&D Systems® IHC指南)

 

6. 如何做对照?

合适的对照对解释IHC/ICC的结果的真实性是至关重要的。一个令人满意的IHC/ICC实验设计会有力显示抗原位于正确的特定组织,细胞类型,或亚细胞位置。我们推荐:Endogenous Tissue Background ControlNo Primary Antibody ControlIsotype ControlAbsorption ControlTissue Type Control(具体见R&D Systems® IHC指南)

 

7. ICC,如何选择荧光二抗?

    Northern Lights Fluorescent Secondary Antibodies

a)明亮、不易褪色

b)特异信号强

c)在酒精和二甲苯中稳定

d)应用于荧光显微镜(ICC)、免疫组化(IHC) 、流式细胞仪(Flow Cytometry) 等。

NorthernLights

可相比-荧光分子  Common Fluorescent Secondary Antibodies

NL-493

FITC (492/520) Cy2 (489/506) Alexa Fluor® 488 (494/519)

NL-557

Phycoerythrin, PE (565/575) Rhodamine Red X (570/590)Cy3 (548/562)

NL-637

Allophycocyanin, APC (645/660) Alexa Fluor® 647 (650/668)Cy5 (650/670)

 

8. IHC,如何选择二抗染色试剂盒?

R&D Systems CTS染色试剂盒(Cell and Tissue Staining Kit)是基于LSAB原理的高度优化试剂盒。CTS染色试剂盒在原料上选用高特异性生物素二抗,高灵敏链酶亲和素链接酶(HS Streptavidin-HRP/AP),优化的封闭试剂,并经过不同样本高度优化。R&D Systems生物素二抗,特异性高,低交叉反应;高灵敏链酶亲和素链接酶(HS Streptavidin-HRP/AP)不与磷脂,核酸,及糖类结合蛋白结合,降低实验背景;染色试剂盒提供的4种封闭试剂(过氧化酶, 抗生物素蛋白,生物素, 血清)能有效预防非特异性染色,R&D Systems血清封闭试剂的性能卓越,效果如下图。

(A.未使用血清封闭,B. 使用CTS染色试剂盒中的血清封闭后)

Molecule

Species

Description

Cat. Number

Size

HRP-AEC

Goat

Anti-Goat HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit

CTS009

50 Tests

HRP-DAB

Goat

Anti-Goat HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit

CTS008

50 Tests

HRP-AEC

Mouse

Anti-Mouse HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit

CTS003

50 Tests

HRP-DAB

Mouse

Anti-Mouse HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit

CTS002

50 Tests

HRP-AEC

Rabbit

Anti-Rabbit HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit

CTS006

50 Tests

HRP-DAB

Rabbit

Anti-Rabbit HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit

CTS005

50 Tests

HRP-AEC

Rat

Anti-Rat HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit

CTS018

50 Tests

HRP-DAB

Rat

Anti-Rat HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit

CTS017

50 Tests

HRP-DAB

Sheep

Anti-Sheep HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit

CTS019

50 Tests

HRP-DAB

Sheep

Anti-Sheep HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit

CTS020

50 Tests

 

9. DAB染色信号微弱,需要增强免疫染色?

为更好的将抗原抗体结合的微弱信号进行有效的放大,使很多以前表达较弱的抗原加强染色效果;DAB 增强试剂Catalog # CTS010(浓度为50X 3 mL)可以加强DAB 染色.。使用DAB 增强试剂后, DAB 染色产生灰黑色的染色且背景低。

 

10. 其他IHC问题见:

R&D Systems®,, , IHC指南,中国区技术支持热线800-988-1270提供完善的售后技术服务。

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