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ELISA实验操作中的注意要点

【 日期:2010-11-26 13:07:59  |  浏览次数:4098 】

    ELISA是免疫学检测、诊断研究最常用的方法之一,对于ELISA的检测原理、操作规程都有明确的文献可供参考。ELISA的试剂盒也多种多样,一般只要严格遵照试剂盒所附说明书操作,均能得到理想的结果。这里对实际操作的过程做几点说明
 
1  样本准备
    血清、血浆、体液、细胞培养上清等均可作为ELISA的检测样本。在采集血样和分离血清的过程中应尽可能避免溶血。分离血清时最好在室温或者37 ℃水浴中凝固,而不要放在冰箱凝固。ELISA血清样本要求新鲜,如果要贮藏后再检测,应分装在-20 ℃以下,避免反复冻融。
 
2  加样操作
    目前ELISA试剂盒中使用最多的是检测抗原的“双抗体夹心法”和检测抗体的“间接法”,检测的第一步均是加样本。加样操作需要注意的是应使样本均匀分布到96孔板的孔底。在加样量为50μl(以下)时,容易出现将样本加到孔壁的情况,应尽可能避免。多数试剂盒所检测的样本量为100μl,因此这个问题并不经常出现。随后加入标记抗体、显色底物时均应注意加到孔底。
 
3  孵育洗涤
    孵育一般要求为37 ℃,需要用封板膜对96孔板进行密封,然后在37 ℃温箱内进行。ELISA及其他在96孔板上进行的免疫学检测反应最重要的步骤便是洗涤。洗涤可在自动洗板机上进行,亦可手工洗涤。自动洗板机洗涤时,应注意洗涤程序是否符合ELISA及试剂盒说明书的要求。一般要求洗涤3-5次,每次2-3分钟。需要注意的是,ELISA反应的洗涤,在每次洗涤过程中各反应孔是注满洗涤液的,即洗涤液是在反应孔中维持2-3分钟。而其他一些方法(如时间分辨荧光检测)的洗涤要求是,反应孔注满洗涤液后即迅速将洗涤液吸尽。因此在使用多功能自动洗板机的时候应该注意这一点。手工洗涤时,可使用洗瓶或者输液瓶来向反应孔注液。手工洗涤第一次洗涤可以采用“过洗”,即甩干样本后,快速浸满洗涤液迅速甩干,这可以进一步避免交叉污染。手工洗涤后要求将平板在吸水纸上拍干,此时应注意:1,勤换吸水纸,务必避免吸水纸的碎屑粘到反应孔内;2,ELISA一般能够承受力度较大的“拍板”(而时间分辨荧光等不能,这也是两种方法在自动洗板机上洗涤程序不同的原因),因此最好对96孔板上的可拆卸板条进行标记,以防板条脱落而混淆。
 
4  结果判断
    ELISA结果判断一般是根据显色底物的显色深浅进行的。显色反应仍要求在37 ℃下进行,约需10分钟,然后用终止液终止显色反应,并用酶标仪检测特定波长下的吸光度。由于酶标仪对各反应孔的检测光路是垂直方向的,因此在进行检测时,应保持各反应孔孔底的整洁;同时,显色底物、终止液的量也应该准确,因为孔内液体的量将影响到最后的读数。

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