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R&D ELISA常见问题回答
发布时间:2018-06-19

问: R&D Systems 有分装试剂吗?
答:没有分装试剂。 R&D Systems 公司不会分装,也没有授权任何公司进行分装。目前市场上所谓的“RD 分装试剂是没有品质保证的 3 无产品, R&D Systems 公司不承担任何“RD 分装试剂的售后服务。在此,建议广大客户和经销商从 R&D Systems 中文网站上公布的正规经销商处订购。

 

问:人的 Quantikine ELISA 试剂盒是否有相关的对照?
答: R&D Systems 为人的 Quantikine ELISA 试剂盒提供三重对照组。请同我们联系以便确定产品的目录号。


问:我想使用你们目录中的重组蛋白作为我的ELISA 的对照,但我发现质量上有差异。这是为什么?
答:首先要考虑的是重组蛋白的质量会高出试剂盒的可测试范围数倍,必须将重组蛋白稀释多次才能得到试剂盒的测试范围。一般来说是从 mg/毫升稀释到 pg/毫升,在这中间光是移液管的误差就达到了可测量的水平。
其次要考虑的是 R&D Systems 的免疫测试方法测量的蛋白水平是用一种抗体捕获的、用第二种抗体测定的,这种测定是在试剂盒研发时与标准蛋白校正过的。这些经过测定的早期标准蛋白成为基本校正物,后来的标准都同它校正。这样不同生产批号的免疫测定试剂盒将是一致的。这些基本校正物蛋白质量的测量方法也许与你的试剂管中蛋白质量的测定方法有所不同。


问:什么是竞争性 ELISA?
答:竞争 ELISA 基于竞争结合技术,即样本中的待测分子与固定量的标记的同样分子(我们一般用碱性磷酸酶作为标记)同时与固定在孔板上的抗体的同一结合位点进行竞争,参照标准曲线,试验数据值是定量的。


问:什么是夹心 ELISA
答:夹层 ELISA 采用对样本中分析物的特异的抗体作为固定化的捕获抗体,然后用第二个带标记的抗体作检测,检测抗体对分析物也是专一的。当参照标准曲线时,试验数据值是定量的。


问:什么是直接 ELISA
答:直接 ELISA 是将被测的分析物直接包膜在微孔板表面,然后用测试抗体来证实被测分析物的存在。当与重组蛋白(标准曲线)进行参照时,试验数据值是半定量的。


R&D Systems Parameter 品牌的 ELISA 试剂盒可以做多少个样本?
答: R&D Systems Parameter 品牌的 ELISA 试剂盒可以做 6 点的标准曲线、对照和 41 个样本(每个样本做双份)。


R&D Systems Quantikine 品牌人的 ELISA 试剂盒可以做多少个样本?
答:大多数 R&D Systems Quantikine 品牌人的 ELISA 试剂盒可以做标准曲线、对照和 40 个样本(每个样本做双份)。


R&D Systems Quantikine 品牌的小鼠、大鼠和猪的 ELISA 试剂盒可以做多少个样本?
答: Quantikine 品牌的小鼠或大鼠的 ELISA 试剂盒中的每一微孔板可以做标准曲线、对照和 39 个样本(每个样本做双份)。 Quantikine 品牌的小鼠或大鼠的 ELISA 试剂盒中,有些有两个微孔板,有些只有一个微孔板。


R&D Systems 建议用什么样的 ELISA 微孔板来做 DuoSets 和抗体配对实验?
答:在 R&D Systems 本部,我们用 Costar 的微孔板(目录#2592)。Costar 的电话是(800)492-1110


R&D Systems 用什么纯度的 BSA ELISA
答:为了 ELISA,我们采用 Serological Proteins BSA(目录#82-045)。 Serological Proteins 的电话是(815)937-8270


Quantikine ELISA 试剂盒里都包括什么?
答: R&D Systems Quantikine ELISA 试剂盒是一个完整的试剂盒。它包含了一个已包板的微孔板、酶标抗体、标准蛋白、稀释剂、底物、终止剂、洗液和微孔板密封膜。所有试剂盒对实验说明书中所列样本都经充分验证,确保高质量。


:什么是 DuoSet
答: DuoSet ELISA 开发系统提供了足够的捕获抗体、测试抗体、标准蛋白和 Streptavidin-HRP,可以做大约十五个 96 孔微孔板的实验。我们还提供了样本试验流程和与这一系统配套的试剂。 DuoSet ELISA开发系统主要是为高通量筛选细胞培养的上清液所设计,但熟悉 ELISA 研发的实验人员已成功将其推广到血清和血浆样本的使用。


:什么是 R&D Systems 的抗体配对?
答: R&D Systems的抗体配对是一个自己动手的产品。 R&D Systems建议此产品的使用者在免疫测试的开发方面应很有造诣。使用者必须以经验为依据来决定捕获抗体和测试抗体的最佳浓度。 R&D Systems的重组细胞因子并未经ELISA校正,所以在使用前必须经ELISA做质量校正。更多有关ELISA开发的信息可参照我们的《ELISA开发指导》 (网站: http://www.rndsystems.com/tsg_detail_objectname_elisa_development.aspx) 。


Quantikine QuantiGlo ELISA 试剂盒有何不同?
答: R&D Systems Quantikine 牌子的 ELISA 试剂盒是一种比色法检测,需要一台标准读光仪配备有合适的滤光片可用于读数和光波长校正。 QuantiGlo ELISA 试剂盒采用了一种荧光底物,计数为光流明或相对光单位(RLU)。因此, QuantiGlo ELISA 试剂盒需要有荧光读光仪。这种荧光读光仪需设置在: 1.0分钟的滞待时间; 1.0 /孔的读数时间;累计状态;自动获取开启。 R&D Systems 使用 Dynex Technologies 的荧光读光仪。


:普通 Quantikine ELISA 试剂盒同高灵敏 Quantikine ELISA 试剂盒有何不同?
答:高灵敏 Quantikine ELISA 试剂盒一般用于非常低量的细胞因子的检测,比如正常人(健康状态时)的血清和血浆。当普通 Quantikine 试剂盒一般检测不到(或几乎检测不到)正常人血清和血浆中的细胞因子,可选择高灵敏 Quantikine。我们建议实验者先查阅文献资料来确定试验的测试范围以选择所需的试剂盒的种类。


R&D Systems Quantikine 试剂盒是否可用于组织匀浆(或其它未经检验的)样本?
答:很遗憾, R&D Systems 尚未采用组织匀浆作为样本对 Quantikine 系列的试剂盒做效果验证。如果要决定试剂盒是否可用于未经检定的样本,实验者最好先做一个掺入和回收预试验。简单来说,实验者将样本分为两份:一份中掺入一定量的试剂标准,然后做一稀释系列(一般稀释到 1:16),再将掺入过的一份同未掺入的一份相比。采用以下的公式来计算回收率(%):测试值(pg /毫升) / 期待值(pg /毫升) x 100% = % 回收率。一般来说,回收率在 80-120%可认为是可接受的。但是,可接受范围应由每一实验室自行决定。这种方法可用于检定未被 R&D Systems 检定的任何样本。我们还有更加详细的掺入和回收的实验步骤,可向我们的技术服务部索取。我们也可进一步查阅文献看一看是否有其他试验人员用我们的产品做过不同的样本,或不同的属种。


:加入稀释剂是否会将样本进一步稀释?
答:因为稀释剂是加入到所有的孔中,标准和被测样本都被同样稀释,所以样本的浓度可从标准曲线读出,而不需作稀释调整。


:我是否可将标准曲线的两端延伸?
答:在任何情况下,我们都不支持超出确定范围的实验结果。在我们确定的测试范围,我们保证实验结果的可重复性。


:为什么不将测试范围延伸到所述的灵敏度?
答:灵敏度是统计中大于零的可测到的最低值。它是通过本底信号和试验的可变性计算出来的。灵敏度是将 20 个零复制物的中值加两个标准差从标准曲线换算成分析物的浓度。而最低标准是我们可以放心的、仍可与标准曲线成直线相关的最低点,因而是可定量的。


Quantikine 试剂盒中的试剂是否可互换?
答:如果试剂盒(RD1-, RD5-, RD6-)中的稀释剂有相同的组件号和批量号,它们可以互换。R&D Systems整个试剂盒的质量控制,就是说,我们不支持不同批号之间的替代。在任何情况下,微孔板和共轭都不可互换。


Quantikine 试剂盒中的洗液是否可互换?
答:如果组件号相同,洗液在相同类型的试剂盒之间(普通试剂盒之间,或高灵敏度试剂盒之间)是可以互换的。但是,普通 Quantikine 试剂盒中的洗液不能用于高灵敏度的试剂盒,在普通 Quantikine 试剂盒中的洗液含有磷酸,会干扰高灵敏Quantikine 试剂盒中由 NADPH 驱动的信号扩增。


:在某些实验中为什么必须使用聚丙烯(polypropylene)的试管做标准稀释?
答:有些细胞分子会粘到玻璃或聚苯乙烯(polystyrene),但不粘聚丙烯。


:在 Quantkine 试剂盒中没有足够的 RD5 校正物来稀释我的细胞上清液,我该怎么办?
答:你可用细胞培养液来做起始的稀释,直接移液到微孔板的最终的 1:10 稀释可使用校正物来稀释。


:我的 Quantikine 试剂盒中的 RD1 测试稀释剂看上去有沉淀物,可以用吗?

答:有些 RD1 测试稀释剂的确有不同程度的沉淀物。在这种情况下,我们在实验步骤手册中已做纪录。


:标准曲线为什么要采用 4-pl 拟合?
答: R&D Systems 在研发和质控我们绝大多数的 Quantikine ELISA 试剂盒时,采用 4-相参数的曲线拟合(又名为 4-pl sigmoidal 曲线拟合)。一般来说,它比 log-log 和直线有更好的曲线拟合。如果数据分析不可用 4-pl 的话, log-log 是下一个最好的选择。


:试验步骤中说要用 500 rpm,我的摇床达不到。这个速度是正确的吗?
答: 500 rpm 使用的是 0.12 英寸的震荡轨道。如果你的震荡器用更大的震荡轨道, 500 rpm 的确是过快了。在这种情况下,你应根据 R&D Systems 的建议重新调整震荡速度。你可拿一个多余的 96 孔微孔板,加入洗液,洗液的量与实验时孔中的溶液量一致;封板后,调整震荡器的速度,直到液体在孔的上部剧烈旋转但不溅到封膜上或产生泡沫为止。


:我有太大变异系数(CV)的问题,是怎么回事?
答:最大但不是唯一的两个原因,可能是移液误差和清洗方式。你可参照我们的《如何成功地操作ELISA指导》,网址: http://www.rndsystems.com/tsg_detail_objectname_elisa.aspx

Quantikine ELISA 试剂为什么需要做稀释?
答:主要有两个原因:一,在绝大多数的样本中细胞因子的含量非常高,如不经稀释,读数将高于标准曲线;二,也是最普遍的原因我们建议做稀释,是将样本中的干扰或基质效应稀释掉。


:我是否可以在任何过夜步骤停止 Quantikine 试验、延长温育时间、或提高温育的温度?
答: R&D System 不建议对任何 Quantikine ELISA 延长温育时间。而且,当实验步骤改变了,我们无法保证 Quantikine ELISA 的实验结果。 R&D System 整个试剂盒的质量控制,就是说我们无法支持改变过的实验步骤,因为它们未经质量控制。延长温育时间、或提高温育温度以缩短温育时间会提高实验的本底(又名空白或零标准)。这样一来,样本和标准中的低量细胞因子会测不到,因为增高了的本底信号将从所有孔中的数值中差减。


:我用了 DuoSet ELISA 开发系统,但几乎就没有颜色产生。那些步骤可能出了问题?
答:很多方面都会影响到颜色的产生。比如:
1) BSA
的干扰。选择不含脂肪酸的 ELISA 级别的 BSA 很重要,可以降低球蛋白对实验的干扰。 R&DSystems 建议使用 Serological Proteins BSA(目录#82-045)。

2) 非室温下的试剂在使用时会抑制信号;如果室温过低,信号也会被抑制。
3)
如果使用了未表明为高结合性 ELISA”的微孔板,捕获抗体同微孔板的结合就不牢固,从而导致测试的颜色产生过低。
4)
任何试剂,如果配制出错、储藏不当、或已过期,都将出现这一问题。
5)
读板时使用的波长同低物的波长不一致。


:我是否可以使用你们的抗体配对 ELISA 中的抗体,但用另一家公司的蛋白为标准?
答:若使用一家公司的抗体而用另一家公司的标准的带来问题是它们会有不同的免疫活性(或不同的抗体与重组蛋白的结合力)。这种现象的出现是因为作为标准的重组蛋白同作为抗体免疫原的重组蛋白在蛋白序列或折叠中会有所不同,如果蛋白序列或折叠的不同发生在抗体结合部位,就会引起抗体对重组蛋白标准的不识别或识别很差。



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