发布时间：2010-06-24

R&D Systems位于细胞生物学行业领先地位，2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果，而且可以反映组织生理学的真实结果。R& D Systems抗体交叉反应低，特异性高，保证了真实可靠的信号结果。

1. R&D Systems一抗的质量如何？
      为保障实验结果的可靠性，使用低交叉反应的高品质抗体。RD抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原，而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试，避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费，保证了真实可靠的信号结果。

2. R&D Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗？区分IHC和ICC吗？
R&D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选，能特异性识别石蜡和冰冻切   片中的抗原，IHC和ICC相互通用。

3. 做IHC/ICC, 选择单抗还是多抗？

单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗，由单个B细胞克隆产生的，具有高亲 和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族，单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变，如由于蛋白相互作用，翻译后修饰，温度，pH，固定，盐浓度等，单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。

由于多抗可以识别多个表位，不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说，在一定的pH值和盐浓度范围内，多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因，多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同，R& D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗（货号以AF开头），该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性，更加适合IHC/ICC实验。

4.一抗试剂的孵育条件？一抗浓度，温度，时间？
一抗抗体浓度，稀释，孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化，以达到高特异性，低背景的信号。一般的优化过程是，保持固定的孵育时间和温度，同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如，使用一只高亲特异性抗体，可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间；或者，相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。 为促进特异性染色，常选用较长的孵育时间及较低温度下进行（如室温和4°C）。
R＆D Systems的染色优化方案: 对于组织切片，起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞，起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗 (1.7-15 ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果，孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时，建议进行预实验测试教广的抗体浓度。

一抗孵育的起始优化条件

样本	抗体
	单抗	多抗
组织	5-25ug/mL, 4℃孵育过夜	1.7-15ug/mL, 4℃孵育过夜
细胞	5-25ug/mL, 室温孵育1小时	1.7-15ug/mL, 室温孵育1小时
优势	单抗原表位特异性	工作浓度低
劣势	易受抗原表位的变化影响	非特异性高，需经过抗原亲和纯化

5.做石蜡切片IHC，推荐什么抗原修复技术?

背景知识：日常工作中所使用的10％福尔马林固定的石蜡包埋组织，经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原，阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联，使被封闭的抗原充分暴露，抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节，不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。

R&D Systems建议客户采用热修复的方法，并提供了高度优化的抗原修复试剂，有效修复抗原并提高免疫反应的效果：碱性抗原修复液(Catalog # CTS013), 酸性抗原修复液 (Catalog # CTS014) ，中性pH 7.0抗原修复液(Catalog # CTS015) ，含有前3种修复液的综合修复液 (Catalog # CTS016)。在R&D Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复 (Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。

抗原未修复                                            抗原修复后

人小脑组织Neuroplastin 65

一抗：3 μg/mL goat anti-human/mouse Neuroplastin 65 polyclonal antibody ：Catalog # AF5360
抗原修复：Antigen Retrieval Reagent-Basic (Catalog # CTS013).
染色：Anti-Goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit (brown, Catalog # CTS008) and counterstained with hematoxylin (blue).

6.如何做对照?
合适的对照对解释IHC/ICC的结果的真实性是至关重要的。一个令人满意的IHC/ICC实验设计会有力显示抗原位于正确的特定组织，细胞类型，或亚细胞位置。我们推荐：Endogenous Tissue Background Control，No Primary Antibody Control，Isotype Control，Absorption Control，Tissue Type Control。

7.做IHC，如何避免非特异性染色？如何选择染色试剂盒？
所有IHC/ICC研究具体取决于抗体抗原结合，由疏水作用，离子相互作用，氢键结合以及其他分子间作用力等控制。然而，同样的引力也可能导致非特异性染色，即一抗结合了抗原表位以外的氨基酸。这是在IHC/ICC中是一个常见的问题。我们面临的挑战是减少非特异性相互作用，而不影响抗体的抗原表位结合。

非特异性染色的原因包括一抗和二抗与和血清蛋白的相互作用，抗体和组织间的离子相互作用，能影响IHC检测系统的内源性分子的相互作用。这些问题可能导致高背景从而无法观察到目标蛋白的表达位置。通过使用阻断剂(a blocking reagent)，可以修正非特异性染色体，而这些修正步骤都必须在一抗孵育之前完成。

封闭效果比较：

石蜡包埋的人扁桃体组织CD14
A.未经动物血清封闭 B.使用动物血清室温封闭15分钟
实验试剂：抗人CD14生物素化亲和纯化多抗（货号：BAF383，Sheep IgG），碱性抗原修复液(货号：CTS013)，R&D Systems^®高敏染色试剂盒（CTS019，Sheep Kit）

内源性过氧化酶的影响

A. 未灭活内源性过氧化酶 B. 过氧化酶灭活试剂处理15分钟

R&D Systems^® 高敏IHC染色试剂盒（Cell and Tissue Staining Kit）是基于LSAB原理的高度优化试剂盒。高敏IHC染色试剂盒在原料上选用高特异性生物素二抗，高灵敏链酶亲和素链接酶（HS Streptavidin-HRP)。高灵敏链酶亲和素链接酶（HS Streptavidin-HRP)不与磷脂，核酸，及糖类结合蛋白结合，只与生物素化二抗节后，降低实验背景；染色试剂盒提供的4种封闭试剂（过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清）能有效预防非特异性染色。

Molecule	Species	Description	Cat.No.	Size
HRP-AEC	Goat	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS009	50Tests
HRP-DAB	Goat	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS008	50Tests
HRP-AEC	Mouse	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS003	50Tests
HRP-DAB	Mouse	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS002	50Tests
HRP-AEC	Rabbit	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS006	50Tests
HRP-DAB	Rabbit	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS005	50Tests
HRP-AEC	Rat	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS018	50Tests
HRP-DAB	Rat	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS017	50Tests
HRP-DAB	Sheep	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS019	50Tests
HRP-DAB	Sheep	Cell&Tissue Stain Kiit	CTS020	50Tests

优点 即开即用

高检测灵敏度

适合冰冻切片，石蜡包埋切片，悬浮细胞等，

适合细胞涂片(cytospin)(如淋巴细胞，单核细胞，转染细胞)

适合多种一抗，如goat, mouse, rabbit, rat, sheep IgG.

组分 4种封闭试剂（过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清）

高特异性生物素二抗

高灵敏链酶亲和素HRP（HS Streptavidin-HRP)

DAB (褐色) or AEC (红色) 染料和缓冲液

一抗：10 μg/mL 山羊抗人Wnt-2 亲和纯化多抗(货号 AF3464).
抗原修复: 碱性热修复 (货号 CTS013).
染色：R&D Systems^®高敏染色试剂盒 (棕色，货号CTS008，Goat Kit) ；苏木精复染(蓝色).
实验方法: IHC Enzymatic Protocol 1.0.

8.做ICC，如何选择荧光二抗？

NorthernLights荧光抗体耐光漂白，明亮，是多色荧光显微的理想选择。他们的光谱接近几个常用的荧光染料，可与普通过滤器设备或激光器配套使用（见下表）。

优点 明亮、不易褪色

特异信号强

在酒精和二甲苯中稳定

应用于荧光显微镜(ICC)、免疫组化(IHC) 、流式细胞仪(Flow Cytometry) 等。

NorthernLights 2th Antibody	Cat.No.	Abs/Em Maxima	Laser(Ex)	Fluorochromes(Abs/Em)
NL-493 anti-sheep IgG	NL012	493/514	Argon (488)	FITC (492/520) Cy™2 (489/506) Alexa Fluor® 488 (494/519)
NL-493 anti-Rabbit IgG	NL006
NL-493 anti-Mouse IgG	NL009
NL-493 anti-Rat IgG	NL015
NL-493 anti-Goat IgG	NL003
NL-493 Streptavidin	NL997
NL-493 anti-Chicken IgY	NL018
NL-557 anti-sheep IgG	NL010	557/574	Rypton (568) HeNe (543)	Phycoerythrin (565/575) Rhodamine Red™ X (570/590) Cy™3 (548/562)
NL-557 anti-Rabbit IgG	NL004
NL-557 anti-Mouse IgG	NL007
NL-557 anti-Rat IgG	NL013
NL-557 anti-Goat IgG	NL001
NL-557 Streptavidin	NL999
NL-557 anti-Chicken IgY	NL016
NL-637 anti-sheep IgG	NL011	637/658	HeNe (633)	Allophycocyanin (645-660) Alexa Fluor® 647 (650-668) Cy™5 (650/670)
NL-637 anti-Rabbit IgG	NL005
NL-637 anti-Mouse IgG	NL008
NL-637 anti-Rat IgG	NL014
NL-637 anti-Goat IgG	NL002
NL-637 Streptavidin	NL998
NL-637 anti-Chicken IgY	NL017

9.DAB染色信号微弱，需要增强免疫染色？

为更好的将抗原抗体结合的微弱信号进行有效的放大，使很多以前表达较弱的抗原加强染色效果；DAB 增强试剂Catalog # CTS010（浓度为50X ，3 mL)可以加强DAB 染色。使用DAB 增强试剂后, DAB 染色产生灰黑色的染色且背景低。

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